如何提高活体成像的深度和穿透力

　　活体成像技术作为一种革命性的生物医学研究工具，允许科学家在不伤害动物的情况下，实时观察和分析活体动物体内的生物学过程。这项技术在肿瘤学、神经科学、免疫学和药物开发等领域具有广泛的应用。然而，活体成像的深度和穿透力一直是制约其应用效果的关键因素。本文将探讨如何提高活体成像的深度和穿透力，以期为相关领域的研究提供参考。

　　一、活体成像技术的基本原理与挑战

　　活体成像技术主要基于生物发光和荧光成像这两种方法。生物发光成像利用荧光素酶基因对细胞或DNA进行标记，当荧光素酶与其底物荧光素相遇时，会发生化学反应，从而产生明亮的光信号。而荧光成像则采用荧光蛋白或特殊染料作为标记物，这些标记物在外界激发光源的照射下会发出荧光。这些穿透组织的光信号随后被体外高精度的CCD设备捕捉，经过处理，最终转化为清晰、详尽的图像。

　　然而，活体成像技术在实际应用中面临着诸多挑战。生物组织中的成分复杂，如蛋白质、脂质和血红素等物质对光的传播造成阻碍，导致光信号在穿透组织时发生散射和吸收，从而降低了成像的深度和穿透力。此外，不同波长的光在组织中的穿透深度也不同，选择合适的成像波长对于提高成像效果至关重要。

　　二、优化成像波长以提高穿透力

　　在NIR-II波段中，水的吸收峰值(接近1450 nm)处，成像可以获得最高的图像对比度。研究表明，通过选择接近1450 nm的成像波长，可以最大程度地减少散射的影响，并提高图像的对比度。这是因为在这个波长下，水的吸收作用较强，能够减少散射光对成像质量的干扰。

　　具体来说，在活体成像实验中，可以使用近红外波长的荧光染料或荧光蛋白作为标记物。这些标记物在受到激发光照射时，会发出接近1450 nm的荧光信号，该信号在组织中的穿透深度较大，且受散射影响较小。例如，使用iRFP(远红外荧光蛋白)作为报告基因，其荧光信号在组织中的穿透深度可达数厘米，且具有较高的信噪比。

　　三、减少散射和吸收以提高成像深度

　　除了优化成像波长外，还可以通过减少散射和吸收来提高活体成像的深度。以下是一些有效的策略：

　　使用光透明技术

　　光透明技术是一种让生物组织具有光学透明性的新型技术。通过使用一种或多种试剂组成的混合液通过浸泡、电泳或灌注等处理方式，可以使大块组织或完整器官达到视觉下透明或光学仪器下可见的效果。这种技术能够显著降低组织对光的散射和吸收作用，从而提高成像的深度和穿透力。例如，在活体颅骨光透明实验中，使用光透明试剂盒可以使小鼠大脑皮层神经网络、血管网络及血流流速的观察与监测变得更加清晰和深入。

　　优化动物体位和方向

　　实验动物体内的光学信号会被组织干扰从而发生衰减。为了达到最大的模型灵敏度，需要确定能够发出最高信号强度的动物体位和方向。研究者可以从多个位置拍摄图像，以确定最佳的动物体位和方向。此外，强烈建议在动物之间使用分隔板，以防止信号的反射和互相干扰。

　　减少动物毛发和皮肤的干扰

　　深色的动物毛发和皮肤色素会吸收和散射入射光和发射光。因此，尽可能使用无毛、白化或Hr突变的动物品系。如果由于动物模型的遗传背景或免疫能力状况不允许，可以在成像前做脱毛处理。脱毛处理应在成像前24小时前进行，以避免皮肤炎症对成像结果的影响。

　　四、提高成像设备的性能

　　除了优化成像波长和减少散射和吸收外，还可以通过提高成像设备的性能来提高活体成像的深度和穿透力。以下是一些有效的策略：

　　使用高数值孔径物镜

　　高数值孔径物镜能够收集更多的光信号，从而缩短曝光时间并改善成像质量。在活体成像实验中，使用高数值孔径物镜可以提高图像的清晰度和穿透深度。

　　优化荧光滤光片

　　荧光滤光片是活细胞荧光成像实验最重要的硬件之一。选用具有高透射率的滤光片可以收集尽可能多的荧光信号，从而提高信噪比并改善成像质量。

　　使用锁焦设备

　　由于活体样本会四处移动，因此务必确保在延时实验期间可以正确捕获焦平面图像。使用锁焦设备可以减少达到正确对焦位置所需的Z轴帧数，从而避免在延时实验中多次暴露样品于激发光照明下，提高成像的稳定性和深度。

　　五、优化成像条件以提高成像效果

　　除了上述策略外，还可以通过优化成像条件来提高活体成像的深度和穿透力。以下是一些有效的策略：

　　选择合适的底物注射方式

　　不同的底物注射方式会对生物发光造成不同的影响。例如，腹腔注射和尾静脉注射各有优缺点。腹腔注射底物迅速分布全身并能穿过包括大脑在内的血液组织屏障但峰值时间较长;尾静脉注射则提供更好的再现性和高信号但注射难度较高且代谢较快。因此，在选择底物注射方式时需要根据实验需求进行权衡。

　　优化曝光时间和像素合并

　　曝光时间和像素合并是影响图像信噪比的重要因素。在活体成像实验中，需要根据实验需求选择合适的曝光时间和像素合并方式以提高信噪比和穿透深度。例如，在BLI实验中，可以使用适当的像素合并和短曝光时间拍摄初始图像;如果没有检测到信号，则使用更高的像素合并和更长的曝光时间。

　　给动物喂食无自发荧光的饮食

　　在荧光成像实验中，动物的饮食可能会影响成像效果。例如，如果动物饮食中含有富含叶绿素的植物苜蓿，动物肠道就会产生NIR自发荧光。为了避免基于叶绿素的自发荧光对成像结果的影响，建议在成像前一周开始给动物喂食不含苜蓿的饮食。

　　六、多模态成像技术的应用

　　结合多种成像技术可以实现多模态成像，从而同时获取不同层面的生物信息并增强研究的深度和广度。例如，可以结合荧光成像、生物发光成像和光学成像等技术来实现对活体动物体内生物学过程的全面监测和分析。这种多模态成像技术不仅能够提高成像的深度和穿透力，还能够为科学研究提供更加丰富和准确的数据支持。

　　七、总结与展望

　　提高活体成像的深度和穿透力是一个涉及多个方面的复杂问题。通过优化成像波长、减少散射和吸收、提高成像设备的性能、优化成像条件以及应用多模态成像技术等方法，可以有效地提高活体成像的深度和穿透力。未来，随着成像技术的不断发展和完善，相信活体成像技术在生物医学研究中的应用前景将更加广阔。

　　总之，提高活体成像的深度和穿透力是一个需要不断探索和实践的过程。通过综合运用多种策略和方法，可以不断优化成像效果并为科学研究提供更加准确和可靠的数据支持。