小动物活体成像常见问题分析

小动物活体成像常见问题分析。小动物活体成像技术是一种先进的生物医学研究工具，它能够在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究。这种技术广泛应用于肿瘤生长、感染进程、基因表达变化等多个领域。然而，在实际应用中，研究人员可能会遇到各种问题。本文将对小动物活体成像技术中的常见问题进行分析和解答，帮助读者更好地理解和应用这一技术。

一、技术原理及基本组成

小动物活体成像技术主要基于荧光素酶基因的标记和荧光素底物的注射，通过高度灵敏的成像设备来捕捉发光信号。荧光素酶基因通过分子生物学克隆技术插入到预期观察的细胞的染色体内，然后通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。将标记好的细胞注入小鼠体内后，观测前需要注射荧光素酶的底物——荧光素。在ATP和氧气的存在下，荧光素酶会催化荧光素的氧化反应，从而产生发光现象。这种发光现象只在活细胞内发生，且光的强度与标记细胞的数目呈线性关系。

二、常见问题解答

1. 荧光素酶的发光是否需要激发光？

荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素（Luciferin）。荧光素酶的发光强度与标记的细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。

2. 荧光素是如何进入小鼠体内的？

荧光素通常通过腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg。20克的小鼠需要约3毫克的荧光素。常用方法是腹腔注射，这种方法扩散较慢、开始发光慢、持续发光时间长。若进行荧光素静脉注射，扩散快、开始发光快，但发光持续时间很短。

3. 标记的肿瘤接种以后，会发生Luciferase的丢失吗？

标记的肿瘤接种后，Luciferase丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明Luciferase基因的标记非常稳定。可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。

4. 标记细胞中的荧光素酶基因是随机插入还是插入固定的位点？

插入的位点是随机的，但每一个构建好的细胞株都做过详细的分析，与其母细胞株进行详细的比较，证明荧光素酶的插入对细胞的各种特性（包括生长周期、成瘤性等）没有造成影响。

5. 如何保证荧光素酶（Luciferase）的稳定性？

荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。荧光素酶的半衰期约三个小时，所以只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。

6. 不同的组织对光的吸收程度不一样，不同的组织之间能进行定量研究吗？

目前，大部分文献都是同样的组织比较，进行同样组织的前后不同时间的定量分析。荧光素酶的发光强度同标记的靶点，包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。但由于可见光是漫射光，在体内走的路线不是直线，所以该仪器的体内光源的分辨率不是很好，通过该仪器观察的发光图片不能代表发光物质的结构信息，在动物体表所捕捉的发光信号只能代表发光的强度和大概的位置。

7. 如何确定最佳的检测时间？

荧光素腹腔注射老鼠后约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到稳定的最高点。在最高点持续约20-30分钟后开始衰减，约三小时后荧光素排除，发光全部消失。最好的检测时间是在注射后15到35分钟之间。但建议实验人员在做不同实验模型前进行连续时间点发光曲线的绘制，以确定最高稳值的时间范围。

8. 在in vitro的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？

荧光素酶基因标记的细胞株是经过单克隆筛选培养过的稳定的细胞株。体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长，接种代数不要很多。但若接种的代数过多，建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度。

9. 标记好的细胞的荧光素酶基因在细胞中有多少个COPY，在什么位点？

对于实验来说，细胞中的copy数目和标记的位点通常不影响实验结果。标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子，显示细胞的数目。标记基因一般用此基因的启动子，与此基因平行表达，显示此基因的表达数目。启动子的活性高，则荧光素酶的表达高；启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。

10. 小动物活体成像技术有哪些优缺点？

小动物活体成像技术的主要优点是实时长期监测体内的各种生物学过程，背景噪声低，灵敏度高，无放射性，不损伤体内正常细胞。然而，该技术也存在一些缺点，如成本较高，波长短穿透力差，细胞构建耗时费力。

三、应用及前景

小动物活体成像技术不仅在科研中具有重要意义，还在临床诊断和治疗中发挥着越来越大的作用。通过这种技术，可以非侵入性地观察和分析小动物体内的细胞活动，为疾病研究和治疗提供有力支持。例如，在癌症研究中，生物发光成像技术可以无创监测肿瘤生长、转移及治疗效果，助力抗癌药物研发。在免疫与干细胞研究中，该技术可以标记细胞，连续追踪造血干细胞及淋巴细胞，揭示免疫应答及治疗的细胞机制。此外，该技术还可以用于标记病毒、细菌，进行基因表达和蛋白质相互作用的研究。

随着科学技术的不断发展，小动物活体成像技术也在不断进步和完善。未来，该技术有望在疾病诊断、药物筛选、基因治疗等领域发挥更加重要的作用。同时，研究者们也在不断探索新的成像技术和方法，以提高成像的分辨率和灵敏度，进一步拓展小动物活体成像技术的应用范围。

综上所述，小动物活体成像技术是一种强大的生物医学研究工具，但在实际应用中可能会遇到各种问题。通过深入理解和解答这些问题，可以帮助研究人员更好地应用这一技术，推动生物医学研究的进展。