小动物活体成像技术原理及常见问题分析

小动物活体成像技术原理及常见问题分析。小动物活体成像技术是一种先进的影像学方法，它能够在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究。这项技术通过高灵敏度光学仪器，使研究人员能够非侵入性地追踪活体动物体内细胞、基因活动及疾病过程，如肿瘤生长、感染进程等。本文将详细阐述小动物活体成像技术的原理，并探讨一些常见问题。

一、小动物活体成像技术原理

小动物活体成像技术主要分为可见光成像（荧光成像、生物发光成像）、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和超声成像（Ultrasound）五大类。其中，可见光成像技术是目前应用最广泛的一种。

1. 生物发光成像

生物发光成像技术利用荧光素酶基因标记细胞或DNA。荧光素酶是一种能够催化荧光素（底物）产生生物荧光的酶，其发光反应需要O2和Mg2+参与，有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。将荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过特定的启动子过表达，从而在细胞中表达荧光素酶。当外源给予其底物荧光素时，荧光素酶催化荧光素的氧化反应，产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。

2. 荧光成像

荧光成像技术采用荧光物质或荧光物质标记的抗体、纳米材料、药物等导入到活体体内，通过外界激发光源激发获取成像。常用的荧光报告基团包括绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。这些荧光蛋白在特定波长的光线激发下，会发出不同颜色的荧光，从而实现对目标细胞或分子的追踪。荧光成像技术具有费用低廉、操作简单、标记靶点多样等优点，但其背景噪音较强，灵敏度较低。

二、小动物活体成像技术常见问题分析

1. 荧光素酶的发光是否需要激发光？

荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素（Luciferin）。荧光素酶与荧光素反应产生的光是自发荧光，不需要外界光源的激发。

2. 荧光素如何进入小鼠体内？

荧光素可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内。约一分钟就可以扩散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg。20克的小鼠约需3毫克的荧光素。

3. 如何保证荧光素酶（Luciferase）的稳定性？

荧光素酶基因是插到细胞染色体上的，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。荧光素酶的半衰期约三个小时，只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。因此，在细胞分裂、转移、分化等过程中，荧光素酶的稳定性得以保证。

4. 标记的肿瘤接种以后，会发生Luciferase的丢失吗？

丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。有一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明Luciferase基因的标记非常稳定。可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。

5. 光学原理及影响因素

光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。

影响成像效果的因素包括底物给药方式、荧光标记物波长和动物毛发等。腹腔注射荧光素可以迅速分布全身，但发光持续时间较长；尾静脉注射则发光强度高但持续时间短。荧光标记物的波长越长，穿透性越好，信噪比也越高。动物毛发会显著衰减光信号，因此在成像前需要进行脱毛处理。

6. 实验过程及操作技巧

小动物活体成像实验通常包括以下步骤：通过分子生物学克隆技术，将荧光素酶的基因插入预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。将标记好的细胞注入小鼠体内后，观测前需要注射荧光素酶的底物——荧光素。应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件进行观测和记录。

在实验过程中，需要注意以下几点技巧：选择支持实验目的的报告子（Reporter）；给动物喂食无自发荧光的饮食；确定最佳的动物体位和方向；优化信噪比（SNR）；选择适当的底物注射途径；成像前清洁实验动物和仪器；建立生物发光信号的动力学曲线；避免像素传感器饱和等。

三、小动物活体成像技术的应用

小动物活体成像技术因其非侵入性、高灵敏度、全身成像、实时成像和高通量等优点，被广泛应用于生物医学研究领域。具体应用包括：

药物研发：小动物成像技术可以帮助研究人员评估新药物的疗效和毒性，加速新药物的开发和上市进程。

神经科学研究：小动物成像技术可以用于研究小动物的神经系统结构和功能，探索神经系统疾病的发病机制和治疗方法。

肿瘤研究：小动物成像技术可以用于研究小动物肿瘤的形成、生长和转移过程，评估抗肿瘤药物的疗效，探索肿瘤治疗的新途径。

细胞追踪：小动物成像技术可以用于研究小动物体内细胞的位置、分布和迁移情况，探索细胞生物学和组织工程的研究问题。

基因表达：小动物成像技术可以用于研究小动物体内基因表达的情况，探索基因调控和信号转导的研究问题。

四、结语

小动物活体成像技术是一种强大的研究工具，它能够在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行深入研究。通过不断优化和创新，小动物活体成像技术将在科学研究和医学诊断中发挥更加重要的作用，为人类健康和生物科学的发展做出更大的贡献。然而，在实际应用中，研究人员还需要注意各种影响因素和操作技巧，以确保实验结果的准确性和可靠性。