活体成像技术如何实现细胞追踪
活体成像技术如何实现细胞追踪。活体成像技术（in vivo imaging technique）是一种在不损伤实验动物的前提下，利用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。这一技术通过非侵入式、直观的方式，观测活体动物体内肿瘤的生长、转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。活体成像技术因其操作简便、结果直观、灵敏度高等特点，在生命科学、医学研究及药物开发等领域得到了广泛应用。本文将详细介绍活体成像技术如何实现细胞追踪。
一、活体成像技术的原理
活体成像技术主要包括生物发光（Bioluminescence）和荧光（Fluorescence）两种技术。生物发光技术利用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（如GFP、RFP、Mcherry等）标记细胞或蛋白等研究对象。
1.1 生物发光技术原理
生物发光技术通过在哺乳动物体内表达荧光素酶基因，使标记的细胞或DNA在给予其底物荧光素（luciferin）后能够发光。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应，将部分化学能转化为光能释放。由于这种发光现象只存在于活细胞内，且光的强度与标记细胞的数目线性相关，因此可以实现对活细胞内细胞数量的定量研究。
1.2 荧光技术原理
荧光技术则采用荧光报告基团标记细胞或蛋白，利用激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。这种技术的标记对象较为广泛，可以是动物、细胞、微生物、基因，也可以是抗体、药物、纳米材料等。常用的荧光报告基团包括绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（DsRed）等。
二、活体成像技术的实现步骤
活体成像技术实现细胞追踪的步骤包括细胞标记、构建动物模型、活体成像及图像分析。
2.1 细胞标记
细胞标记是实现活体成像技术的基础。通过分子生物学克隆技术，将荧光素酶的基因稳定整合到预期观察的细胞的染色体内，培养出能稳定表达荧光素酶蛋白的细胞株。对于荧光技术，则采用荧光报告基团直接标记细胞或蛋白。
细胞标记的具体步骤包括质粒的扩增和纯化、细胞转染、单克隆细胞筛选及荧光素酶活性鉴定。首先，制备带有荧光素luc转酶报告基因或编码荧光蛋白基因的真核表达质粒并进行扩增纯化。然后，取对数生长期的目标细胞进行转染，将目标细胞、脂质体转染试剂及足量的质粒载体悬浮液共培养一段时间后，补充新鲜的培养液。接着，通过单克隆细胞筛选技术，挑选出稳定表达荧光素酶的细胞株。最后，利用荧光素酶活性鉴定系统，筛选出高效表达的细胞株。
2.2 构建动物模型
构建动物模型是实现活体成像技术的重要环节。根据实验目的，可以选择尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞。例如，在肿瘤模型研究中，将荧光素酶基因标记的肿瘤细胞接种到小鼠体内，可以建立各种肿瘤模型，用于实时观察体内肿瘤细胞的增殖、生长、转移情况。
2.3 活体成像
活体成像过程通常包括背景图拍摄、生物发光或荧光成像及图像叠加分析。首先，将实验动物（如小鼠）经过麻醉系统麻醉后放入成像暗箱平台，利用软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。然后，自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为生物发光或荧光成像。与第一次的背景图叠加后可以清楚地显示动物体内光源的位置，完成成像操作。
2.4 图像分析
图像分析是获取实验数据的关键步骤。利用成像软件，使用者可以方便地选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。软件可以计算出选定区域发出的光子数，从而获得实验数据。此外，软件还提供了多种图像分析功能，如发光面积、总光子数、光子强度的相关参数，供实验者参考。
三、活体成像技术的应用
活体成像技术在细胞追踪领域具有广泛的应用，包括肿瘤模型研究、药物代谢研究、免疫细胞研究、干细胞研究、基因表达与基因功能研究等。
3.1 肿瘤模型研究
活体成像技术可以实现肿瘤细胞活体成像，通过观察在细胞内用荧光素酶标记的蛋白从而建立细胞模型，适时检测肿瘤生成和细胞衰老情况。小动物活体成像系统能通过对发光信号的检测而追踪肿瘤的转移过程，包括观察癌细胞在血管中的停留、外渗和转移灶等一系列过程。此外，还可以利用荧光染料或放射性同位素标记药物，直接在活体水平观察到药物对肿瘤的是否靶向肿瘤、最佳靶向时间及药物在动物其它器官组织的积累。
3.2 药物代谢研究
活体成像技术可以标记与药物代谢有关的基因，研究不同药物对该基因表达的影响，从而间接获知相关药物在体内代谢的情况。在药剂学研究方面，可通过把荧光素酶报告基因质粒直接装在载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律。在药理学方面，可用荧光素酶基因标记目的基因，观察药物作用的通路。
3.3 免疫细胞研究
活体成像技术可以标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移等功能。这对于研究免疫系统的功能和疾病机制具有重要意义。
3.4 干细胞研究
活体成像技术可以标记干细胞，观察干细胞在体内的增殖、分化及迁移的过程。这对于研究干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
3.5 基因表达与基因功能研究
活体成像技术可以将荧光素酶基因插入到目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。通过检测报告基因的表达情况，可以实现对目的基因的研究。这种技术可以用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，观察药物诱导特定基因表达，以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。
四、活体成像技术的影响因素
活体成像技术在实际应用中受到多种因素的影响，包括CCD的性能、实验所采用的细胞和基因的表达情况、荧光标记物的选择、荧光素酶成像时底物浓度和温度的影响以及自发荧光的干扰等。因此，在进行活体成像实验时，需要综合考虑这些因素，以获得准确可靠的实验结果。
五、结论
活体成像技术通过非侵入式、直观的方式，实现对活体动物体内细胞追踪的研究。这一技术以其操作简便、结果直观、灵敏度高等特点，在生命科学、医学研究及药物开发等领域得到了广泛应用。随着技术的不断发展和完善，活体成像技术将在未来发挥更加重要的作用，为疾病的早期诊断和治疗提供新的手段和方法。