小动物活体成像系统成像质量如何提升

一、系统硬件层面的优化

（一）CCD相机的升级

CCD相机作为小动物活体成像系统的核心部件，其性能直接影响成像质量。在像素设计上，大像素点能增加灵敏度，像素面积越大，对光越灵敏，可产生更多信号，例如采用高bin值拍摄时，大像素点拍摄方法能获取更多信号，拍摄到微弱发光点。然而，像素点增大也会降低分辨率，导致图像清晰度变差甚至出现马赛克现象；小像素点虽能增加分辨率，但像素点面积越小，感光性能越低，信噪比越低，动态范围越窄。因此，需在大的像素点和小的像素点之间取得平衡。

动态范围以bit值表现，深度为16位意味着图像含有2¹⁶种颜色深度的变化，这样的CCD才能准确表现所检测到的荧光信号的微小差异，在图像上表现出不同的深浅或色彩差异。信噪比的高低对成像质量更为关键，其与QE值、读出噪声和暗噪声等因素有关。温度与暗电流密切相关，一般情况下温度越低，因温度产生的暗噪声越低，但当温度降低到一定程度时，乱真电荷会出现，增加暗电流的值。所以，温度对于CCD来讲并非越低越好，而是存在一个最佳值，既降低温度带来的噪声，又不引起乱真电荷的增加。

（二）暗箱与麻醉系统的改进

暗箱需经过特殊设计，以有效避免外界光线及宇宙射线对成像的影响。例如，一些先进的暗箱采用密封结构，能够有效阻挡外界光线的干扰，为成像提供稳定的环境。麻醉系统则要确保动物在成像过程中处于稳定的麻醉状态，避免因动物活动导致成像模糊。例如，采用气体麻醉方式，能够精确控制麻醉深度，使动物在成像过程中保持安静，减少运动伪影的产生。

（三）光源与滤光片的选择

荧光光路系统采用高功率窄带宽LED，具有强度更高、寿命更长、光衰更小的优点，全局对称式排列能提供更均匀的光线输出。数量众多的窄带宽滤光片搭配复杂的光谱分离算法，能够实现对多种荧光探针的分离，大大减少荧光背景对实验结果的干扰。例如，在多通道、多标记的荧光成像实验中，通过合理选择滤光片，可以有效区分不同荧光探针的信号，提高成像的准确性和清晰度。

二、实验操作层面的优化

（一）动物模型的准备

动物毛发处理：动物毛发颜色对成像质量有显著影响，白毛小鼠的自发荧光最为强烈，黑毛小鼠则可能对信号产生严重遮挡。因此，最佳选择是使用无毛或白化动物品系。若条件受限，可采用脱毛器或脱毛膏对预期发光部位或整个腹部进行脱毛处理。例如，在成像前一天，通过剃毛或化学脱毛清除观察区域的毛发，确保最大程度地收集信号。

动物饲料选择：常规啮齿动物饲料中含有的紫花苜蓿会导致小鼠腹部出现自发荧光，其峰值波长约为680nm，可能掩盖或模拟定位于腹部附近的荧光探针的信号。因此，建议采用无苜蓿或纯化饲料，以迅速降低肠道自发荧光，提升荧光成像的信噪比。

动物体位调整：实验动物体内的光学信号会被组织干扰从而发生衰减，信号源越深，信号衰减越大。为了达到最大的模型灵敏度，需确定能够发出最高信号强度的动物体位和方向。例如，研究者可以从多个位置拍摄图像，以确定最佳的动物体位和方向。同时，建议在动物之间使用分隔板，防止信号的反射和互相干扰。

（二）成像参数的设置

曝光时间与像素合并：在生物发光成像（BLI）中，使用适当的像素合并（如4×4）和短曝光时间（5秒）拍摄初始图像。若未检测到信号，则使用更高的像素合并（8×8或16×16）以及更长的曝光时间（从60秒开始，必要时可延长到600秒）。对于荧光成像（FLI），通常通过从中到高的像素合并（4×4或8×8）和从短到中的曝光时间（5到30秒）来实现最好的信噪比（SNR），但要避免长时间曝光，以免导致来自组织自体荧光所造成的背景噪音升高。

底物注射途径与剂量：选择BLI底物注射途径时应考虑病变部位因素。最常用的是经腹膜腔注射（IP）途径注射D-荧光素，对于全身和皮下疾病模型非常理想。但对于腹膜腔疾病模型，经皮下（SC）注射可给出最好的图像，因为IP注射可能导致人为地提高腹膜腔生物发光信号。静脉注射（IV）方法可产生更明亮的图像，但峰值信号的窗口通常仅在注射后2—5分钟出现，较难捕捉。在D-荧光素的使用上，成像当天准备新鲜的溶液，并给予150mg/kg的IP剂量，以在大多数小鼠模型中实现一段时间的荧光素酶饱和动力学。

（三）成像环境的控制

清洁处理：动物衬垫、食物和皮屑都可能产生背景荧光信号。因此，在成像之前，一定要擦拭净动物爪子，清洁成像平台，最好用浸透70%乙醇的纸巾擦拭。

温度控制：哺乳动物生物发光成像中，荧光素酶成像是一种酶和底物的生化反应，生物荧光成像不可避免地受到底物浓度和动物体温度的影响。活体成像系统的暗箱和检测平台应保持良好的恒温状态，以保证动物的体温恒定在37℃。

三、数据分析层面的优化

（一）光谱分离技术

Living Image成像和分析软件具备光谱分离技术，能实现组织自发背景荧光去除及多探针成像。在复杂的成像实验中，不同荧光探针的信号可能会相互干扰，通过光谱分离技术，可以将不同探针的信号准确分离出来，提高成像的准确性和可靠性。

（二）动力学曲线建立

生物发光信号强度反映的是荧光素酶底物的动态变化，这些动态变化作为疾病相关的病理和生理结果，通常是组织依赖性的，也可以随着时间的推移而变化。在运用BLI的研究中，应识别生物发光的峰值并比较其在实验过程中的经时变化，最好通过在每个成像时间点建立生物发光动力学曲线来实现。这种曲线是在荧光素注射后的一系列时间点内，通过对动物进行注射、麻醉、然后成像来建立的。通常，成像开始于注射后5分钟，每5—10分钟重复一次，并在信号强度开始下降时结束。

四、多模态成像的融合应用

多模态小动物活体光学成像系统最好同时具备高灵敏生物发光成像（BLI）、荧光成像（FLI）、X-射线成像、切伦科夫成像（Cerenkov）以及明场成像功能，能进行2D/3D成像和定量分析，并能将多种成像模式进行融合展示和进一步分析。例如，通过BLI、FLI和明场照片叠加图像的三模态成像，可以对生物发光的肿瘤细胞与荧光标记的治疗分子的相对位置进行评估；通过生物发光共振能量转移（BRET）成像、荧光素酶和NIR荧光探针共表达、用荧光素酶活性的共振能量激发NIR荧光探针，可以实现低背景的NIR FLI和高SNR的BLI。

提升小动物活体成像系统的成像质量需要从系统硬件、实验操作、数据分析和多模态成像融合等多个层面进行优化。通过不断改进和优化这些方面，可以获得更准确、更清晰的成像结果，为小动物活体成像研究提供更有力的支持。